NK細胞活性檢測方法
NK細胞是一種異質(zhì)性、多功能的細胞群，具有抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)功能，并參與移植排斥反應(yīng)和某些自身免疫性疾病的發(fā)生，因而通過制備NK細胞克隆對其功能進行研究已受到人們的高度重視。測定人NK細胞活性多以K562細胞株作為靶細胞，而測小鼠NK細胞活性則用YAC細胞株，檢測方法多種多樣。
(一)形態(tài)法
將效應(yīng)細胞與靶細胞按一定比例混合溫育，繼而用臺盼藍或伊紅Y等活細胞拒染的染料處理，然后分別計數(shù)著染的死細胞和不著染的活細胞，推算NK細胞活性。
1．材料
(1)靶細胞：K562細胞株或YAC細胞株。
(2)效應(yīng)細胞：NK細胞。
(3)含15％NCS的RPMI 1640培養(yǎng)液，5％臺盼藍染色液。
2．方法：
(1)效應(yīng)細胞的制備：將克隆的NK細胞用含15％NCS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度至l×107／ml，備用。
(2)靶細胞的制備：取經(jīng)24h培養(yǎng)的靶細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌1次，1000r／min離心6min。棄上清液，用：RPMI 1640培養(yǎng)液重懸后計數(shù)，并用0．5％臺盼藍染色計數(shù)，活細胞數(shù)達95％以上時可用作靶細胞。以RPMI l640培養(yǎng)液調(diào)整至1×105／ml，備用。
(3)效應(yīng)細胞靶細胞作用：用40孔培養(yǎng)板，對照組1～3孔，每孔加100μl靶細胞，再加入RPMI 1640培養(yǎng)液100μl；實驗組4～6孔，每孔加100gl靶細胞，再加入效應(yīng)細胞100μl，效應(yīng)細胞與靶細胞的比例為50：1?；靹?，置5％CO2 37℃孵箱中培養(yǎng)過夜。
3．結(jié)果分析取m培養(yǎng)板，將細胞輕輕混勻成懸液，從每孔中取出30μl細胞懸液，加等量O．5％臺盼藍染液混合。室溫下5min后，計數(shù)白細胞數(shù)。對照組和實驗組每孔各計數(shù)100個細胞，分別記錄死亡細胞和活細胞數(shù)，求出各組NK細胞活性的均值。
(二)酶釋放法
將效應(yīng)細胞與靶細胞按一定比例混合溫育，離心沉淀，取上清液檢測靶細胞遭破壞后釋放出的酶含量。
(三)熒光法
用熒光素標汜靶細胞，經(jīng)與效應(yīng)細胞共溫后，離心去上清液，用熒光計檢測剩余的活靶細胞的熒光。
(四)核素法
將效應(yīng)細胞與靶細胞按一定比例混合共溫后，離心檢測上清液或剩余靶細胞放射性的量，間接反映其活性。有靶細胞胞漿釋放法和胞核釋放法兩種。
(五)化學(xué)發(fā)光法
當(dāng)效應(yīng)細胞與靶細胞接觸時，效應(yīng)細胞呼吸暴發(fā)，生成極不穩(wěn)定的O 2-及OH一，放出光子，在發(fā)光劑存在條件下，可被光電倍增管接受和計數(shù)，發(fā)光量與NK細胞殺傷能力相關(guān)。
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